Minggu, 05 November 2017

makalah PCR



BAB I
PENDAHULUAN
1.1  Latar Belakang

Bioteknologi diartikan sebagai penerapan prinsip ilmu dan rekayasa dalam pemanfaatan makhluk hidup (bakterifungivirus, dan lain-lain) maupun produk dari makhluk hidup (enzim,alkohol) dalam proses produksi untuk menghasilkan barang dan jasa. Bioteknologi secara umum berarti meningkatkan kualitas suatu organisme melalui aplikasi teknologi. Aplikasi teknologi tersebut dapat memodifikasi fungsi biologis suatu organisme dengan menambahkan gen dari organisme lain atau merekayasa gen pada organisme tersebut.
Genetika adalah ilmu yang mempelajari sifat-sifat keturunan (hereditas) serta segala sluk beluknya selama ilmiah. Genetika disebut juga ilmu keturunan, ilmu ini mempelajari berbagai aspek yang menyangkut pearisan sifat, bagaimana sifat keturunan ilmu itu diturunkan dari generasi kegenerasi serta variasi-variasi yang mungkin timbul didalamnya atau yang menyertainya. Pewarisan sifat tersebut dapat terjadi melalui proses seksual. Genetika berusaha membawakan material pembawa informasi untuk diwariskan (bahan genetik), bagaimana informasi tersebut di ekspresikan ekspresi genetic dan bagaimana informasi tersebut dipindahkan dari individu satu ke individu lain. PCR adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya.
1.2  Rumusan masalah
Adapun rumusan masalah pada makalah ini ialah :
1.      Apa pengertian dari PCR ?
2.      Apa komponen-komponen dari PCR ?
3.      Bagaimana proses PCR ?
4.      Bagaimana aplikasi dari PCR ?
5.      Bagamana prinsip kerja PCR?
1.3  Tujuan
Adapun tujuan masalah pada makalah ini ialah :
1.      Untuk mengetahui pengertian dari PCR
2.      Untuk menjelaskan komponen-komponen dari PCR
3.      Untuk menjelaskan proses PCR
4.      Untuk mengetahui aplikasi dari PCR
5.      Untuk mengetahui prinsip dari PCR

BAB II
PEMBAHASAN
2.1 Pengertian PCR
Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk melipatgandakan suatu sekuens nukleotida tertentu secara in vitro. Metode ini dikembangkan pertama kali oleh Kary B. Mulis pada tahun 1985. Metode ini sekarang telah banyak digunakan untuk berbagai macam manipulasi dan analisis genetic. Pada awal perkembanganya metode ini hanya digunakan untuk melipatgandakan molekul DNA, tetapi kemudian dikembangkan lebih lanjut sehingga dapat digunakan pula untuk melipatgandakan dan melakukan kuantitas molekul mRNA. 
Dengan menggunakan metode PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 106-107 kali. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap  siklus PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target. Metode PCR dapat dilakukan dengan menggunakan komponen dalam jumlah yang sangat sedikit, misalnya DNA cetakan yang diperlukan hanya sekitar 5µg, oligonukliotida yang digunakan hanya sekitar 1 mM dan reaksi ini biasa dilakukan dalam volume 50-100 µl. DNA cetakan yang digunakan juga tidak perlu dimurnikan terlebih dahulu sehingga metode PCR dapat digunakan untuk melipatgandakan suatu sekuens DNA dalam genom bakteri.
PCR adalah reaksi polimerase berantai, yaitu reaksi yang melibatkan enzim polimerase yang dilakukan secara berulang-ulang. Yang diulang-ulang adalah proses pemisahan untai  ganda DNA menjadi untai tunggal, hibridisasi primer untuk mengawali replikasi DNA dilanjutkan dengan proses penambahan basa pada cetakan DNA oleh enzim polimerase, untuk melakukan kegiatan ini dibutuhkan tabung PCR yang bersifat reponsif dengan perubahan suhu dan mesin thermal cycler, suatu mesin yang mampu menaikkan dan menurunkan suhu dengan cepat, dan bahan-bahan untuk membuat reaksi PCR.
Konsep asli teknologi PCR mensyaratkan bahwa bagian tertentu sekuen DNA yang akan dilipatgandakan harus diketahui terlebih dahulu sebelum proses pelipatgandaan tersebut dapat dilakukan. Sekuen yang diketahui tersebut penting untuk menyediakan primer, yaitu suatu sekuens oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA dalam reaksi berantai polimerasi.


2.2 Komponen – Komponen PCR
Ada beberapa macam komponen utama dalam proses PCR, yaitu antara lain:
1.    DNA cetakan
DNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan.  Fungsi DNA templat di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama. Templat DNA ini dapat berupa DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA apapun asal di dalam DNA templat tersebut mengandung fragmen DNA target yang dituju.
Reaksi pelipatgandaan suatu fragmen DNA dimulai dengan melakukan denaturasi DNA template (cetakan) sehingga rantai DNA yang berantai ganda (double stranded) akan terpisah menjadi rantai tunggal (single stranded). Denatirasi DNA dilakukan dengan menggunakan panas  selama 1 – 2 menit, kemudian suhu diturunkan menjadi sekitar   sehingga oligonukleotida  primer akan “menempel” (annealing) pada cetakan yang telah terpisah menjadi rantai tunggal. oligonukleotida Primer akan membentuk jembatan hydrogen dengan cetakan pada daerah sekuen yang komplementer dengan dengan sekuen primer. Suhu   yang digunakan untuk penempelan primer pada dasarnya merupakan kompromi. Amplifikasi akan lebih efisien jika dilakukan pada suhu yang lebih rendah.
2.    Oligonukleotida primer
Oligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek (15 – 25 basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA. Primer yang digunakan dalam PCR ada dua yaitu oligonukleotida yang mempunyai sekuen yang identik dengan salah satu rantai DNA cetakan pada ujung 5’-fosfat, dan oligonukleotida yang kedua identik dengan sekuen pada ujung 3’OH rantai DNA cetakan yang lain. Proses annealing biasanya dilakukan selama 1 – 2 menit. Setelah dilakukan annealing oligonukleotida primer dengan DNA cetakan, suhu inkubasi dinaikkan menjadi   selama 1,5 menit. Pada suhu ini DNA polymerase akan melakukan proses polimerasi rantai DNA yang baru berdasarkan informasi yang ada pada DNA cetakan. Setelah terjadi polimerasi, rantai DNA yang baru akan membentuk jembatan hydrogen dengan DNA cetakan. DNA rantai ganda yang terbentuk dengan adanya ikatan hydrogen antara rantai DNA cetakan dengan rantai DNA yang baru hasil polimerasi selanjutnya akan didenaturasi lagi dengan menaikkan suhu ingkubasi menjadi   . Rantai DNA yang baru tersebut selanjutnya akan berfungsi sebagai cetakan bagi reaksi polimerasi berikutnya.
Reaksi-reaksi seperti yang sudah dijelaskan tersebut diulangi lagi sapai 25 – 30 kali (siklus) sehingga pada akhir siklus akan didapatkan molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru hasil polimerasi dalam jumlah yang lebih banyak dibandingkan dengan jumlah DNA cetakan yang digunakan. Banyaknya siklus amplifikasi tergantung pada kosentrasi DNA target di dalam campuran reaksi. Paling tidak, diperlukan 25 siklus untuk melipatgandakan satu kopin sekuen DNA target di dalam genom mamalia agar hasilnya dapat dilihat secara langsung, misalnya dengan elektroforosis gel agarose. Akan tetapi, pada umumnya kosentrasi DNA polimerasi Taq menjadi terbatas setelah 25 – 30 siklus amplikasi.
3.    Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP)
Shanghai ShineGene Molecular Biotech,Inc. (2009) menyatakan bahwa campuran dNTP adalah larutan air pada pH 7,0 yang mengandung dATP, dCTP, dGTP dan dTTP, masing-masing pada konsentrasi akhir baik 10mm atau 25mm. dNTP yang siap digunakan merupakan solusi yang dirancang untuk menghemat  waktu dan untuk menyediakan reproduktifitas yang lebih tinggi  dalam aplikasi PCR dan lainnya.
4.    DNA Polimerase
Pada awal perkembangannya, DNA polymerase yang digunakan dalam PCR adalah fragmen Klenow DNA polymerase I yang berasal dari Escherichia coli (Mullis dan Fallona, 1989). Fragmen Klenow adalah DNA polymerase yang telah dihilangkan aktivitas eksonuklease (5’ → 3’)-nya. Beberapa kelemahan fragmen Klenow antara lain adalah bahwa enzim ini tidak tahan panas, laju polemerase untuk menggabungkan nukleotida dengan suatu primer secara terus-menerus tanpa terdisosiasi dari komplek primer-DNA cetakan. Hampir semua DNA polymerase mempunyai prosesivitas yang rendah sehingga akan terdisosiasi dari komplek primer-DNA cetakan setelah menggabungkan kurang dari 10 nukleotida. Salah satu perkecualian adalah T7 DNA polymerase yang mampu menggabungkan ribuan nukleotida tanpa terdisosiasi dari komplek primer-DNA cetakan.
a.       Taq DNA Polimerase
Taq DNA polymerase yang berasal dari bakteri Thermus aquaticus BM, yaitu suatu strain yang tidak mempunyai endonuklease retriksi TaqI. Taq DNA polymerase tersusun atas satu rantai polipeptida dengan berat molekul kurang lebih 95 kD. Enzim ini mempunyai kemampuan polimerasi DNA yang sangat tinggi, tetapi tidak mempunyai aktivitas eksonuklease 3’ → 5’. Enzim ini paling aktif pada pH9 (pada suhu 200 C) dan suhu aktivitas optimumnya sekitar 750C – 800C. Kelebihan enzim Taq DNA polimerase adalah bahwa enzim ini tahan terhadap suhu tinggi yang diperlukan untuk memisahkan rantai DNA cetakan. Dengan kelebihan semacam ini maka tidak diperlukan penambahan enzim pada tiap-tiap siklus PCR seperti yang harus dilakukan kalau enzim yang dig unakan adalah fragmen Klenow DNA polymerase I (Gelfand dan White, 1990). Kelebihan lain enzim Taq DNA polymerase adalah laju polimerasinya yang sangat tinggi serta prosesivitasnya yang juga lebih tinggi  disbanding dengan fragmen Klenow.
Taq DNA polymerase mempunyai suhu optimum yang tinggi untuk sintesis DNA yaitu 75 – 80 ͦC. aktivitas spesifik enzim ini dalam menggabungkan nukleotida mencapai 150 nukleotida per detik per molekul enzim. Waktu paruh (half-time) Taq DNA polymerase pada suhu 95 ͦC adalah 40 menit (Gelfand dan White, 1990). Deterjen non-ionik Tween 20 (0,5 -1 %) dapat digunakan untuk meningkatkan efisiensi Taq DNA polymerase. Senyawa tambahan lain yang juga dapat meningkatkan efisiensi polimerasi Taq DNA polymerase adalah DMSO, gelatin, gliserol, dan ammonium sulfat. Salah satu kelemahan enzim Taq DNA polymerase adalah bahwa enzim tersebut mempunyai potensi untuk melakukan kesalahan dalam menggabungkan nukleotida sehingga ada kemungkinan terjadi mutasi pada fragmen gen hasil amplifikasi. Meskipun demikian dengan kondisi yang tepat, kesalahan penggabungan nukleotida semacam itu tidak terjadi seperti misalnya hasil amplifikasi fragmen gen HIV-1 (5400 nukleotida) dengan siklus amplifikasi 30 kali. Demikian juga halnya dengan hasil amplifikasi gen ß-globin (14990 nukleotida). Dengan demikian , rata-rata frekuensi kesalahan penggabungan nukleotida sekitar 5 X   kesalahan per nukleotida yang digabungkan per siklus, dengan menggunakan 25 siklus.
b.      Tth DNA polimerse 
Enzim DNA polimerse lain yang juga dapat digunakan untuk melakukan PCR adalah Tth DNA polimerse. Enzim ini diisolasi dari eubakteri thermofilik Thermus thermophilus HB8. Tth DNA polimerse mempunyai prosesivitas yang tinggi dan tidak mempunyai aktivitas eksonuklease 3’ → 5’. Enzim ini menunjukkan aktivitas tertinggi pada pH 9 (pada suhu 25) dan suhu sekitar  . Selain aktivitas polymerase, enzim ini juga mempunyai aktiviatas transcriptase balik (reverse transcriptase) intrinsik yang sangat efisien dengan adanya ion mangan. Aktivitas trankriptase balik tersebut jauh lebih tinggi disbanding dengan aktivitas serupa yang dimiliki oleh DNA polymerase I yang ada pada Escherichia coli maupun pada Taq  DNA polymerase. Tth DNA polimerse juga dapat menggunakan substrad yang dimodifikasi sehingga juga dapat digunakan untuk melabel fragmen DNA dengan radionukleotida, digoxigenin maupun biotin.
Oleh karena enzim Tth DNA polimerse mempunyai aktivitas transkiptase balik yang tinggi pada suhu tinggi maka enzim ini dapat digunakan untuk mengatasi masalah yang timbul akibat adanya struktur skunder pada molekul RNA. Dengan demikian, enzim ini dapat digunakan untuk melakukan RT-PCR (reverse Transkriptase PCR). Molekul cDNA yang diperoleh dari hasil reaksi transkripsi balik dapat sekaligus diamplifikasi dengan menggunakan Tth DNA polimerse dengan adanya ion  . Enzim ini dapat dilakukan untuk melakukan RT-PCR molekul RNA sampai ukuran 1000 pasangan basa.
c.       Pwo DNA polymerase
Enzim Pwo DNA polymerase diisolasi dari archaebacterihiperthermofilik Pyrococcus woesei. Enzim Pwo DNA polymerase mempunyai berat molekul sekitar 90 kD. Enzim ini mempunyai prosesivitas polimerasi 5’   3’ yang tinggi, mempunyai aktivitas eksonuklease  , dan tidak menunjukkan aktivitas eksonuklease  . Pwo DNA polymerase mempunyai stabilitas thermal yang lebih tinggi dibandingkan dengan Taq DNA polymerase. Waktu paruh enzim ini lebih dari 2 jam pada suhu , sedangkan Taq DNA polymerase hanya mempunyai waktu paruh 5 menit pada suhu ini. Aktivitas eksonuklease 3’   5’ (aktivitas proof-reading dalam proses sintesis DNA) yang dimiliki oleh Pwo DNA polymerase meningkatkan ketepatan (fidelity) proses sintesis DNA sepuluh kali lebih tinggi dibandingkan dengan ketepatan yang dimiliki oleh Taq DNA polymerase. Jika Taq DNA polimerse digunakan untuk mengamplikasi sekuen DNA sepanjang 200 bp sebanyak satu juta kali maka kurang lebih 56% produk amplifikasinya akan mangandung satu atau lebih kesalahan. Sebalikya, jika enzim Pwo DNA polymerase yang digunakan untuk amplifikasi maka hanya 10% produk amplifikasinya yang mengandung kesalahan. Ketepatan proses polimerasi DNA secara in vitro merupakan salah satu parameter paling penting dalam PCR. Hal ini terutama sangat penting jika DNA atau RNA cetakan yang digunakan hanya berjumlah sangat sedikit.
Hasil amplifikasi menggunakan Pwo DNA polymerase adalah molekul DNA dengan ujung pepat/tumpul (blunt-ended) sehingga dapat digunakan dalam  proses ligasi ujung tumpul secara langsung tanpa harus dilakukan modifikasi terhadap ujung-ujung molekul DNA. Oleh karena sifat ketepatanya yang tinggi maka enzim ini sangat berguna untuk aplikasi:
·         Cloning produk PCR
·         Studi polimorfisme alel dalam transkrip RNA individual
·          Karakterisasi mutasi yang jarang di dalam suatu jaringan
·          Karakterisasi status alel suatu sel tunggal atau DNA molekul tunggal
·          Karakterisasi populasi sel dalam suatu kultur

d.      Pfu  dan Tli DNA polymerase
DNA polymerase lain yang dapat digunakan untuk PCR adalah Pfu DNA polymerase dan Tli DNA polymerase. Pfu DNA polymerase diisolasi dari  Pyrococcus furiosis, mempunyai berat molekul 92 kD, aktif pada suhu   dan mempunyai aktivitas eksonuklease  . Enzim ini diketahui mempunyai laju kesalahan yang paling kecil disbanding dengan enzim DNA polymerase yang lain. Produk amplifikasi dengan menggunakan enzim ini adalah molekul DNA dengan ujung tumpul. Tli DNA polymerase diisolasi dari jasad Thermococcus litoralis,  sangat stabil terhadap panas, aktivitas optimum pada suhu   dan dapat berfungsi meskipun diinkubasi pada suhu  . Berat molekul enzim ini dalah 90 kD. Enzim juga mempunyai aktivitas eksonuklease  .
e.       PCR buffer dan konsentrasi Mg2+
Buffer standar untuk PCR tersusun atas 50mM KCl, 10mM Tris-Cl (pH8.3) dan 1.5mM MgCl2. Buffer standard ini akan bekerja dengan baik untuk DNA template dan primer dengan kondisi tertentu, tetapi mungkin tidak optimum dengan kombinasi yang lain.  Produk PCR buffer ini terkadang dijual dalam bentuk tanpa atau dengan MgCl2. Konsentrasi ion magnesium dalam PCR buffer merupakan faktor yang sangat kritikal, karena kemungkinan dapat mempengaruhi proses annealing primer, temperatur dissosiasi untai DNA template, dan produk PCR. Hal ini disebabkan konsentrasi optimal ion Mg2+ itu sangat rendah. Hal ini penting untuk preparasi DNA template yang tidak mengandung konsentrasi chelating agent yang tinggi, seperti EDTA atau phosphat. Ion Mg2+ yang bebas bila terlalu rendah atau tidak ada, maka biasanya tidak menghasilkan produk akhir PCR, sedang bila terlalu banyak ion Mg2+yang bebas akan menghasilkan produk PCR yang tidak diinginkan.
2.3 Tahapan Proses PCR
PCR merupakan tehnik amplifikasi DNA selektif in vitro yang meniru fenommena replikasi DNA in vivo. Komponen reaksi yang diperlukan dalam teknik ini adalah untai tunggal DNA sebagai cetakan, primer (sekuens oligonukleotida yang mengkomplementeri  akhiran sekuens cetakan DNA yang sudah ditentukan), dNTPs (deoxynucleotide triphosphates), dan enzim TAQ polimerase yaitu enzim dari bakteri Termovilus aquatikus.
Sejak ditemukannya struktur DNA untai ganda, kita mulai memahami prinsip replikasi DNA terutama kaitannya dengan mekanisme transfer materi genetik. Seperti yang telah dijelaskan dalam materi Asam Nukleat dalam struktur DNA untai ganda tersebut, basa A dan T , juga C dan G , memiliki ikatan hidgrogen yang mudah dirusak dan mudah dibentuk kembali. Untuk melakukan replikasi, mula-mula ikatan hidrogen tersebut harus dirusak dahulu agar DNA untai ganda berubah menjadi untai tunggal. Kemudian karena A selalu berpasangan dengan T, dan C selalu berpasangan dengan G, maka jika kita memiliki satu untai DNA dengan sequens ACTAG, misalnya, maka kita dapat mencetak untai komplementernya, yaitu TGATC, begitu juga sebaliknya. Pada prinsipnya, reaksi PCR ( protokol PCR konvensional ) membutuhkan tiga tahap :
1.      Denaturasi
Denaturasi merupakan proses memisahkan DNA menjadi utas tunggal. Tahap denaturasi DNA biasanya dilakukan pada kisaran suhu 92 – 95 oC. Denaturasi awal dilakukan selama 1 – 3 menit diperlukan untuk meyakinkan bahwa DNA telah terdenaturasi menjadi untai tunggal. Denaturasi yang tidak berlangsung secara sempurna dapat menyebabkan utas DNA terputus. Tahap denaturasi yang terlalu lama dapat mengakibatkan hilangnya aktivitas enzim polimerase.
2.      Annealing
Annealing merupakan proses penempelan primer. Tahap annealing primer merupakan tahap terpenting dalam PCR, karena jika ada sedikit saja kesalahan pada tahap ini maka akan mempengaruhi kemurnian dan hasil akhir produk DNA yang diinginkan. Faktor yang mempengaruhi tahap ini antara lain suhu annealing dan primer. Suhu annealing yang terlalu rendah dapat mengakibatkan timbulnya pita elektroforesis yang tidak spesifik, sedangkan suhu yang tinggi dapat meningkatkan kespesifikan amplifikasi. Kenaikan suhu setelah tahap annealing hingga mencapai 70–74oC bertujuan untuk mengaktifkan enzim TaqDNA polimerase. Proses pemanjangan primer (tahap extension) biasanya dilakukan pada suhu 72oC, yaitu suhu optimal untuk TaqDNA polimerase. Selain itu, pada masa peralihan suhu dari suhu annealing ke suhu extension sampai 70 oC juga menyebabkan terputusnya ikatan-ikatan tidak spesifik antara DNA cetakan dengan primer karena ikatan ini bersifat lemah. Selain suhu, semakin lama waktu extension maka jumlah DNA yang tidak spesifik semakin banyak.
3.      Elongasi
Elongasi merupakan proses pemanjangan DNA. Dalam tahap extension atau sintesis DNA, enzim polimerase bergabung bersama dengan nukleotida dan pemanjangan primer lengkap untuk sintesis sebuah DNA utas ganda. Reaksi ini akan berubah dari satu siklus ke siklus selanjutnya mengikuti perubahan konsentrasi DNA.
Hasil sintesa DNA dalam satu siklus dapat berperan sebagai cetakan (template) pada siklus berikutnya sehingga jumlah DNA target menjadi berlipat dua pada setiap akhir siklus. Dengan kata lain DNA target meningkat secara eksponensial, sehingga setelah 30 siklus akan menjadi milyaran amplifikasi DNA target. 
Ketiga tahap siklus tersebut diulang sesuai dengan jumlah siklus amplifikasi. Pada siklus pertama dua untai tunggal DNA cetakan akan disalin menjadi 2 DNA untai ganda. Pada siklus kedua, 2 DNA cetakan untai ganda masing-masing akan bertindak sebagai cetakan sehingga pada siklus kedua dihasilkan jumlah 4 DNA untai ganda. Pada siklus berikutnya akan dihasilkan jumlah DNA secara eksponensial, dimana pada siklus ketiga DNA akan disalin menjadi 8 kali, siklus ke 10 menjadi 1.024 kali, siklus 30 menjadi 1.073.741.824 dan seterusnya. Pada akhir siklus, DNA cetakan akan digandakan secara eksponensial sehingga dihasilkan DNA dalam jumlah yang berlipat ganda hanya dalam waktu yang relatif singkat sekitar 3-4 jam.
2.4  Aplikasi PCR
Aplikasi PCR utama dibidang klinis adalah untuk diagnosis, dan kloning. Yang paling sering dipakai di bidang klinis saat ini adalah untuk diagnosis, yaitu untuk deteksi patogen infeksius dan identifikasi mutasi pada gen yang berkaitan dengan faktor resiko penyakit.
Untuk aplikasi PCR dibidang klinis tersebut, telah dikembangkan berbagai macam teknis berbasis PCR, antara lain :
·         RFLP-PCR (restriction fragment lenght polymorphisms)
Pada prinsipnya, teknik ini dimanfaatkan untuk deteksi polimorfisme. Secara umum teknik ini menggunakan enzim restriksi untuk mengetahui adanya polimorfisme (RFLP), dan produk hasil digesti tersebut diamplifikasi dengan PCR (RFLP-PCR).
Teknik PCR yang mirip dengan teknik diatas AFLP-PCR (amplification fragment lenght polymorphisme) yang digunakan untuk membedakan isolat atau spesies yang berbeda berdasarkan daerah enzim restriksi (polimorfisme daerah restriksi)
·         VNTR-PCR (variable number of tandem repeat sequence), dan STR-PCR (short tandem repeats). Teknik ini sering digunakan untuk tujuan forensi. Dengan menggunakan primer yang tepat, variasi sekuens pengulangan berurutan yang terdapat pada DNA sampel dapat diketahui.
·         Skreening / deteksi mutasi berbasis PCR
Dahulu, skreening/ deteksi mutasi dapat dilakukan dengan PCR konvensional (misalnya dengan BESS-T-Scan (Base Excision Sequence Scanning)) untuk mendeteksi mutasi T/A atau T / A, atau Amplification refractory mutation system (ARMS) untuk mendeteksi point mutation melalui priming oligonukleotida kompetitif.
·         PCR kuantitatif
Untuk keperluan diagnosis dan penilaian kemajuan tetapi kadang membutuhkan pemeriksaan yang bersifat kuantitatif.
·         PCR konvensional dapat digunakan untuk mendapatkan data kuantitatif tersebut dengan menggunakan kompetitor (internal exogenous standard) atau dengan housekeeping gene(internal endogenous standard). Namun saat ini, penggunaan PCR konvensional untuk PCR kuantitatif telah digantikan real-time PCR. PCR dirancang pada tahun 1985 dab telah memberikan dampak besar pada penelitian biologis dan bioteknologi. PCR telah digunakan untuk memperkuat DNA dari berbagai macam sumber misalnya fragmen DNA kuno dari gajah purba (mammoth) berbulu yang telah membeku selama 40.000 tahun; DNA dari sedikit darah;, jaringan, atau air  mani yang ditemukan di tempat kejadian perkara kriminal; DNA dari sel embrionik tunggal untuk diagnosis kelainan genetik sebelum kelahiran dan DNA gen virus dari sel yang diinfeksi oleh virus yang sulit terdeteksi seperti HIV.
Menurut Darmo dan Ari (2000), teknik PCR dapat didayagunakan (kadang dengan modifikasi) guna fasilitasi analisis gen. Selain itu telah dikembangkan banyak sekali aplikasi praktis. Sebagai contoh teknik dan aplikasi PCR dapat disebutkan sebagai berikut: kloning hasil PCR; sekuensing hasil PCR; kajian evolusi molekular; deteksi mutasi ( penyakit genetik; determinasi seks pada sel prenatal; kajian forensik (tersangka kriminal, tersangka ayah pada kasus paternal); dan masih banyak lainnya. Pendapat lain mengenai manfaat dan aplikasi PCR juga dikemukakan oleh Sunarto (1996) yang menyebutkan bahwa PCR dapat digunakan sebagai alat diagnosis penyakit thalesemia. Menurut Sunarto sebelum cara PCR ditemukan analisis DNA dilakukan dengan prosedur yang panjang dan rumit, yaitu pertama-tama membentuk perpustakaan (library construction) melalui digesti dengan endonuklease restriktif dan kloning, kemudian skrining, mapping, subkloning dan terakhir sekuensing. Tetapi dengan adanya PCR dalam waktu 24 jam sejak pencuplikan vili korialis (chorionic villous sampling) diagnosis prenatal sudah dapat ditegakkan dan berdasarkan prinsip PCR telah dikembangkan cara diagnostik molekular yang terbukti sangat akurat.
Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya:
a.    Isolasi Gen
DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat besar, DNA manusia panjangnya sekitar 3 miliar basa, dan di dalamnya mengandung ribuan gen. Sebagaimana fungsi utama DNA adalah sebagai sandi genetik, yaitu sebagai panduan sel dalam memproduksi protein, DNA ditranskrip menghasilkan RNA, RNA kemudian diterjemahkan untuk menghasilkan rantai asam amino alias protein. Dari sekian panjang DNA genome, bagian yang menyandikan protein inilah yang disebut gen, sisanya tidak menyandikan protein atau disebut ‘junk DNA’, DNA ‘sampah’ yang fungsinya belum diketahui dengan baik. Kembali ke pembahasan isolasi gen, para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk diisolasi. Contoh, sebelumnya mengekstrak insulin langsung dari pankreas sapi atau babi, kemudian menjadikannya obat diabetes, proses yang rumit dan tentu saja mahal serta memiliki efek samping karena insulin dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan insulin manusia. Berkat teknologi rekayasa genetik, kini mereka dapat mengisolasi gen penghasil insulin dari DNA genome manusia, lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E. coli) agar bakteri dapat memproduksi insulin juga. Hasilnya insulin yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan sekarang insulin tinggal diekstrak dari bakteri, lebih cepat, mudah, dan tentunya lebih murah ketimbang cara konvensional yang harus ‘mengorbankan’ sapi atau babi. Untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama ‘probe’ yang memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.
b.    DNA Sequencing
Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan.
c.    Forensik
Identifikasi seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban), atau korban kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak mungkin lagi dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. DNA dapat diambil dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang. Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki pertalian darah, misalnya ibu atau bapak kandung. Jika memiliki kecocokan yang sangat tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang dimaksud. Konon banyak kalangan tertentu yang memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri orang tua ‘sesungguhnya’ dari seorang anak jika sang orang tua merasa ragu.
d.    Diagnosa Penyakit
Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah saat ini, bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa yang cepat dan akurat. PCR merupakan teknik yang sering digunakan. Teknologi saat ini memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam dengan hasil akurat. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah tertentu DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau makhluk lainnya.
Berdasarkan uraian diatas penemuan dan manfaat teknik PCR ini berdampak sangat luas terhadap kemajuan sains dan teknologi secara umum yaitu antara lain sebagai berikut:
1.      Memperkuat gen spesifik sebelum diklon.
2.      Membuat fragmen gen DNA secara berlimpah
3.      Dapat mendeteksi DNA gen virus yang sulit untuk dideteksi
4.      Dapat mendeteksi/ mendiagnosis  DNA sel embrionik yang mengalami kelainan sebelum dilahirkan.
5.      Bidang kedokteran forensik. Contohnya mendeteksi penyakit yang dapat menginfeksi, variasi dan  mutasi dari gen.
6.      Mengetahui hubungan kekerabatan antar spesies atau untuk mengetahui dari mana spesies tersebut berasal.
7.      Melacak asal usul seseorang dengan membandingkan “finger print”


2.5  Prinsip Kerja PCR

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode untuk amplifikasi (perbanyakan) primer oligonukleotida diarahkan secara enzimatik urutan DNA spesifik. Teknik ini mampu memperbanyak sebuah urutan 105-106-kali lipat dari jumlah nanogram DNA template dalam latar belakang besar pada sequence yang tidak relevan (misalnya dari total DNA genomik). Sebuah prasyarat untuk memperbanyak urutan menggunakan PCR adalah memiliki pengetahuan, urutan segmen unik yang mengapit DNA yang akan diamplifikasi, sehingga oligonucleotides tertentu dapat diperoleh. Hal ini tidak perlu tahu apa-apa tentang urutan intervening antara primer. Produk PCR diamplifikasi dari template DNA menggunakan DNA polimerase stabil-panas dari Thermus aquaticus (Taq DNA polimerase) dan menggunakan pengatur siklus termal otomatis (Perkin-Elmer/Cetus) untuk menempatkan reaksi sampai 30 atau lebih siklus denaturasi, anil primer, dan polimerisasi. Setelah amplifikasi dengan PCR, produk ini dipisahkan dengan elektroforesis gel poliakrilamida dan secara langsung divisualisasikan setelah pewarnaan dengan bromida etidium.
PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif.
PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua primer, hanya di dalam tabung reaksi, tanpa perlu memasukkannya ke dalam sel (in vivo). Pada proses PCR dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan (templat) yang mengandung DNA-target (yang akan diamplifikasi) untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, kedua primer akan mengenali dan berikatan dengan untaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan akhir fragmen DNA target, sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan gugus hidroksil bebas pada karbon 3’. Setelah kedua primer menempel pada DNA templat, DNA polimerase mengkatalisis proses pemanjangan kedua primer dengan menambahkan nukleotida yang komplemen dengan urutan nukleotida templat. DNA polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara OH pada karbon 3’ dengan gugus 5’ fosfat dNTP yang ditambahkan. Sehingga proses penambahan dNTP yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase ini berlangsung dengan arah 5’→3’ dan disebut reaksi polimerisasi. Enzim DNA polimerase hanya akan menambahkan dNTP yang komplemen dengan nukleotida yang terdapat pada rantai DNA templat.
Kegunaan :
Polymerase Chain Reaction (PCR) dapat digunakan untuk:
amplifikasi urutan nukleotida.
menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang mengalami mutasi.
bidang kedokteran forensik.
melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan “finger print”.
Reagen Khusus:
5524UB Pasangan primer oligonukleotida sintetik mengapit urutan yang akan diamplifikasi
Buffer PCR 5X (250 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 7,5 mM MgCl2)
Campuran dari empat dNTP (dGTP, dATP, dTTP, dCTP) masing-masing sebesar 2,5 mM (ultra murni DNTP set, Pharmacia # 27-2035-01). DNTP campuran dibuat dengan volume 10 mM larutan dari masing-masing empat dNTP terpisah yang digabung.
Taq DNA Polymerase (AmpliTaqTM, Perkin-Elmer/Cetus)
Minyak mineral ringan
Akrilamida (grade elektroforesis)
N, N’-Methylenebisacrylamide (grade elektroforesis, Ultra-Pure/BRL, # 5516UB)
Amonium persulfat (Ultra-Pure/BRL, # 5523UA)
TEMED (N, N, N’N ‘Tetramethylethylenediamine, Ultra-Murni / BRL, #)




BAB III
PENUTUP
3.1  Kesimpulan
1.      Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk melipatgandakan suatu sekuens nukleotida tertentu secara in vitro. PCR merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasiDNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme.
2.      Adapun komponen dari PCR yaitu DNA cetakan, Oligonukleutida primer, DNA polymerase, Larutan Buffer, dan Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP)
3.      Prinsip dasar dari proses PCR yaitu Tahap pertama Denaturasi. Tahap 2 penempelan. Tahap 3 elongasi. Ketiga tahap siklus tersebut diulang sesuai dengan jumlah siklus amplifikasi. Pada siklus pertama dua untai tunggal DNA cetakan akan disalin menjadi 2 DNA untai ganda. Pada siklus kedua, 2 DNA cetakan untai ganda masing-masing akan bertindak sebagai cetakan sehingga pada siklus kedua dihasilkan jumlah 4 DNA untai ganda. Pada siklus berikutnya akan dihasilkan jumlah DNA secara eksponensial, dimana pada siklus ketiga DNA akan disalin menjadi 8 kali, siklus ke 10 menjadi 1.024 kali, siklus 30 menjadi 1.073.741.824 dan seterusnya
4.      Contoh aplikasi PCR antara lain yaitu proses Isolasi Gen, DNA Sequencing, Forensik dan Diagnosa penyakit.









DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2011. “Makalah Genetika PCR”.  (Online). http://apikdewefppundip 2011.wordpress.com/2012/06/29/makalah-genetika-pcr-polimerase-chain-reaction/.
Yudha. 2012. “Polymerase Chain Reaction (PCR)”. (Online).  http://biologi-yudha. blogspot .com /2012/ 06/ polymerase-chain-reaction-pcr.html.



Tidak ada komentar:

Posting Komentar

makalah PCR

BAB I PENDAHULUAN 1.1   Latar Belakang Bioteknologi diartikan sebagai penerapan prinsip ilmu dan rekayasa dalam pemanfaatan mak...