LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA ANALISIS KULITATIF PROTEIN

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA

ANALISIS KULITATIF PROTEIN

Oleh :

Kelompok 3 A1

Ahmad Hidayat (PO713203151003)

Apriani (PO713203151008)

Desak Nyoman Ayundari (PO713203151013)

Eka Rismawati (PO713203151018)

Muttiara (PO71320315123)

LABORATORIUM BIOKIMIA

AKADEMI ANALIS KESEHATAN

DEPERTEMEN KESEHATAN MAKASSAR

2016

1)      Tujuan Praktikum

a)      Untuk mengidentifikasi adanya protein dengan uji Millon

b)      Untuk mengidentifikasi adanya protein dengan uji Ninhidrin

c)      Untuk mengidentifikasi adanya protein dengan uji Biuret

d)     Untuk mengidentifikasi adanya protein dengan uji Kougulasi

e)      Untuk mengidentifikasi adanya protein dengan uji pengendapan dengan alkohol.

f)       Untuk mengidentifikasi adanya protein dengan uji  Denatuasi protein

2)      Landasan Teori

Protein adalah molekul raksasa yang terdiri dari satuan-satuan kecil penyusunnya yang disebut asam amino yang tersusun dalam urutan tertentu, dengan jumlah dan struktur tertentu. Molekul-molekul ini merupakan bahan pembangun sel hidup. Protein yang paling sederhana terdiri atas 50 asam amino, tetapi ada beberapa protein yang memiliki ribuan asam amino. Hal yang terpenting adalah ketidakhadiran, penambahan, atau penggantian satu saja asam amino pada sebuah struktur protein dapat menyebabkan protein tersebut menjadi gumpalan molekul yang tidak berguna. Setiap asam amino harus terletak pada urutan yang benar dan struktur yang tepat (Poedjiadi, 1994).

Protein yang terdapat dalam makanan kita dicernakan dalam lambung dan usus menjadi asam-asam amino, yang diabsorsi dan dibawa oleh darah ke hati. Sebagian asam amino diambil oleh hati, sebagian lagi diedarkan ke dalam jaringan-jaringan di luar hati. Protein dalam sel-sel tubuh dibentuk dari asam amino. Bila ada kelebihan asam amino dari jumlah yang digunakan untuk biosintesis protein, kelebihan asam amino akan diubah menjadi asam keto yang dapat masuk kedalam siklus asam sitrat atau diubah menjadi urea. Hati merupakan organ tubuh dimana terjadi reaksi katabolisme maupun anabolisme. Asam amino yang dibuat dalam hati, maupun yang dihasilkan dari proses katabolisme protein dibawa oleh darah ke dalam jaringan untuk digunakan. Asam amino yang terdapat dalam darah berasal dari tiga sumber, yaitu absorpsi melalui dinding usus, hasil penguraian protein dalam sel dan hasil sintesis asam amino dalam sel (Poedjiadi, 1994).

Asam amino adalah monomer protein yang mempunyai dua gugus fungsi yaitu gugus amino dan gugus hidroksil. Jumlah asam amino yang terdapat di alam ada beratus – ratus jumlahnya, namun yang diketahui ikut membangun protein hanya sekitar 20 macam. Sifat asam amino antara lain memiliki titik leleh di atas 200 °C, larut dalam senyawa polar dan tidak larut dalam senyawa nonpolar serta memiliki momen dipol yang besar (Anonim a, 2011).

Beberapa Reaksi Uji Protein  (Page, 1989) :

A.    Percobaan berdasarkan reaksi warna:

1)      Percobaan kadar-N

Kapur natron, yaitu campuran NaOH dan Ca(OH)₂  dalam tabung reaksi dengan larutan protein dipanaskan. Keluarlah Amoniak dan Amina.Lakmus merah yang dibasahi menjadi biru.

2)      Reaksi Xantoprotein

Larutan asam nitrat pekat ditambahkan dengan hati-hati ke dalam larutan protein. Setelah dicampur terjadi pengendapan putih yang dapat berubah menjadikuning apabila dipanaskan.. reaksi yang terjadi ialah nitrasi pada inti Benzen yang terdapata pada molekul protein. Jadi, reaksi ini positif untuk protein, fenilalanin dan triptofan. Kulit kita bila kena asam nitrat berwarna kuning, itu juga karena terjadi reaksi xantoprotein ini.

3)      Reaksi Millon

Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat, apabila pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein, akan menghasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi merah oleh pemanasan. Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenol-fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil yang berwarna. Protein yang mengandung tirosin akan memberikan reaksi positif.

4)      Reaksi Biuret

 Larutan Protein + NaOH + CuSO₄   lembayung Berlaku untuk senyawaan yang mempunyai jumlah ikatan peptida > 1. Reaksi ini dapat dipakai untuk penentuan protein secara kualitatif dan kuantitatif.

Beberapa reaksi uji terhadap protein, tes biuret merupakan salah satu cara untuk mengidentifikasi adanya protein, dalam larutan basa biuret memberikan warna violet dengan CuSO₄ karena akan terbentuk kompleks Cu²⁺ dengan gugus CO dan gugus NH dari rantai peptida dalam suasana basa. Pengendapan dengan logam diketahui bahwa protein mempunyai daya untuk menawarkan racun. Salting out, apabila terdapat garam-garam anorganik alam presentase tinggi dalam larutan protein, maka kelarutan protein akan berkurang, sehingga mengakibatkan pengendapan. Pengendapan dengan alkohol, penambahan pelarut organik seperti aseton atau alkohol akan menurunkan kelarutan protein pada kedudukan dan distribusi dari gugus hidrofil polar dan hidrofob polar di dalam molekul hingga menghasilkan protein yang dipol (Tim Dosen Kimia, 2011).

Fungsi protein di dalam tubuh kita sangat banyak, bahkan banyak dari proses pertumbuhan tubuh manusia dipengaruhi oleh protein yang terkandung di dalam tubuh kita. Di bawah ini beberapa fungsi protein yaitu (Anonim b, 2011):

a.              Sebagai enzim

Hampir semua reaksi biologis dipercepat atau dibantu oleh suatu senyawa makromolekul spesifik yang disebut enzim, dari reaksi yang sangat sederhana seperti reaksi transportasi karbon dioksida sampai yang sangat rumit seperti replikasi kromosom.

b.              Alat pengangkut dan penyimpan

Banyak molekul dengan MB kecil serta beberapa ion dapat diangkut atau dipindahkan oleh protein-protein tertentu. Misalnya hemoglobin mengangkut oksigen dalam eritrosit, sedangkan mioglobin mengangkut oksigen dalam otot. Pengatur pergerakan Protein merupakan komponen utama daging, gerakan otot terjadi karena adanya dua molekul protein yang saling bergeseran.

c.              Penunjang mekanis

Kekuatan dan daya tahan robek kulit dan tulang disebabkan adanya kolagen, suatu protein berbentuk bulat panjang dan mudah membentuk serabut. Pertahanan tubuh atau imunisasi Pertahanan tubuh biasanya dalam bentuk antibodi, yaitu suatu protein khusus yang dapat mengenal dan menempel atau mengikat benda-benda asing yang masuk ke dalam tubuh seperti virus, bakteri, dan sel- sel asing lain.

d.             Media perambatan impuls syaraf

Protein yang mempunyai fungsi ini biasanya berbentuk reseptor, misalnya rodopsin, suatu protein yang bertindak sebagai reseptor penerima warna atau cahaya pada sel-sel mata.

e.              Pengendalian pertumbuhan

Protein ini bekerja sebagai reseptor (dalam bakteri) yang dapat mempengaruhi fungsi bagian-bagian DNA yang mengatur sifat dan karakter bahan

Struktur asam amino secara umum adalah satu atom C yang mengikat empat gugus: gugus amina (NH₂), gugus karboksil (COOH), atom hidrogen (H), dan satu gugus sisa (R, dari residue) atau disebut juga gugus atau rantai samping yang membedakan satu asam amino dengan asam amino lainnya. Atom C pusat tersebut dinamai atom C_α("C-alfa") sesuai dengan penamaan senyawa bergugus karboksil, yaitu atom C yang berikatan langsung dengan gugus karboksil. Oleh karena gugus amina juga terikat pada atom C_α ini, senyawa tersebut merupakan asam α-amino. Asam amino biasanya diklasifikasikan berdasarkan sifat kimia rantai samping tersebut menjadi empat kelompok. Rantai samping dapat membuat asam amino bersifat asam lemah, basa lemah, hidrofilik jika polar, dan hidrofobik jika nonpolar (Anonim a, 2010).

Dari struktur umumnya, asam amino mempunyai dua gugus pada tiap molekulnya, yaitu gugus amino dan gugus karboksil, yang digambarkan sebagai struktur ion dipolar. Gugus amino dan gugus karboksil pada asam amino menunjukkan sifat-sifat spesifiknya. Karena asam amino mengandung kedua gugus tersebut, senyawa ini akan memberikan reaksi kimia yang yang mencirikan gugus-gugusnya. Sebagai contoh adalah reaksi asetilasi dan esterifikasi. Asam amino juga bersifat amfoter, yaitu dapat bersifat sebagai asam dan memberikan proton kepada basa kuat, atau dapat bersifat sebagai basa dan menerima proton dari basa kuat (Girindra, 1986).

Semua asam amino yang ditemukan pada protein mempunyai ciri yang sama, gugus karboksil dan amino diikat pada atom karbon yang sama. Masing-masing berbeda satu dengan yang lain pada gugus R-nya, yang bervariasi dalam struktur, ukuran, muatan listrik, dan kelarutan dalam air. Beberapa asam amino mempunyai reaksi yang spesifik yang melibatkan gugus R-nya (Girindra, 1986).

Melalui reaksi hidrolisis protein telah didapatkan 20 macam asam amino yang dibagi berdasarkan gugus R-nya, berikut dijabarkan penggolongan tersebut : asam amino non-polar dengan gugus R yang hidrofobik, antara lain Alanin, Valin, Leusin, Isoleusin, Prolin, Fenilalanin, Triptofan dan Metionin. Golongan kedua yaitu asam amino polar tanpa muatan pada gugus R yang beranggotakan Lisin, Serin, Treonin, Sistein, Tirosin, Asparagin dan Glutamin. Golongan ketiga yaitu asam amino yang bermuatan positif pada gugus R dan golongan keempat yaitu asam amino yang bermuatan negatif pada gugus R. Dari ke-20 asam amino yang ada, dijumpai delapan macam asam amino esensial yaitu valin, leusin, Isoleusin, metionin, Fenilalanin, Triptofan, Treonin, dan Lisin. Asam amino essensial ini tidak bisa disintesis sendiri oleh tubuh manusia sehingga harus didapatkan dari luar seperti makanan dan zat nutrisi lainnya (Girindra, 1986).

3)      Alat dan Bahan

a)      Uji millon

Alat :

·         Tabung reaksi + rak

·         Pipet tetes

·         Pembakar spritus

·         Penangas air   

Bahan :

·         Reagen Millon

·         Larutan protein (larutan putih telur)

b)      Uji ninhidrin

Alat :

·         Tabung reaksi + rak

·         Pipet tetes

·         Pembakar spritus

·         Penangas air

Bahan :

·         Reagen ninhidrin

·         Larutan protein (larutan putih telur)

c)      Uji biuret

Alat :

·         Tabung reaksi + rak

·         Pipet tetes

Bahan :

·         NaOH 2,5 N

·         CuSO₄ 0,01 M

·         Larutan protein (larutan putih telur)

d)     Uji kougulasi

Alat :

·         Tabung reaksi + rak

·         Pipet tetes

·         Pembakar spritus

·         Penangas air

·         Batang pengaduk

Bahan :

·         Asam asetat 1 M

·         Millon

·         Larutan protein (larutan putih telur)

e)      Uji pengendapan dengan alcohol

Alat :

·         Tabung reaksi + rak

·         Pipet tetes

·          

Bahan :

·         HCl 0,1 M

·         NaOH 0,1 M

·         Buffer asetat pH= 4,7

·         Larutan protein(larutan putih telur)

·         Etil alcohol 95 %

f)       Uji denaturasi protein

Alat :

·         Tabung reaksi + rak

·         Pipet tetes

Bahan :

·         HCl 0,1 M

·         NaOH 0,1 M

·         Buffer asetat pH= 4,7

·         Larutan protein( larutan putih telur)

4)      Posedur Kerja

a)       Uji Millon

Tambahkan 5 tetes reagen Millon ke dalam 3 ml larutan protein, panaskan campuran dengan baik. Jika reagen yang di gunakan terlalu banyak, maka akan hilang pada pemanasan.

b)      Uji Ninhidrin

Tambahkan 0.5 ml larutan ninhidrin 0.1 % kedalam 3 ml larutan protein Panaskan,  hingga mendidih.

·      Uji Biuret

Tambahkan 1 ml NaOH 2.5 N kedalam 3 ml larutan protein, aduk sampai rata. Tambahkan setetes CuSO₄ 0.01 M. Aduk, jika timbul warna violet, tambahkan lagi setetes atau dua tetes CuSO_4. 

·      Uji Kougulasi

Tambahkan 2 tetes asam asetat 1 M ke dalam 5 ml larutan protein. Letakkan tabung dalam air mendidih selama 5 menit. Ambil endapan dengan batang pengaduk. Uji kelarutan endapan di dalam air, kemudian uji endapan dengan reagen Millon.

·      Pengendapan dengan alcohol

Lakukan reaksi seperti dalam tabel berikut:

Tabung	1	2	3
Larutan albumin HCl 0,1 M NaOH 0,1 M Buffer asetat ph= 4,7 Etil alcohol 95%	5 ml 1 ml - - 6 ml	5 ml - 1 ml - 6 ml	5 ml - - 1 ml 6 ml

·      Denaturasi Protein

Lakukan reaksi seperti terdapat dalam tabel berikut :

Tabung	1	2	3
Larutan albumin HCl 0,1 M NaOH  0,1 M Buffer asetat ph 4,7	9 ml 1 ml - -	9 ml - 1 ml -	9 ml-\ - - 1 ml

5)      Hasil

6)      Pembahasan

a)      Uji Millon

Uji Millon merupakan uji yang dilakukan untuk menganalisis protein yang mengandung gugus hidroksil fenil yang akan bereaksi dengan pereaksi Millon. Pereaksi Millon berisi larutan merkuri dan ion merkuro dalam asam nitrat dan asam nitrit. Apabila pereaksi ini ditambahkan ke dalam larutan protein yang mengandung asam amino dengan rantai samping gugus fenolik, maka akan menghasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi merah oleh pemanasan. Tetapi khusus untuk proteosa dan pepton secara langsung akan menghasilkan larutan berwarna merah. Endapan yang terbentuk berupa garam kompleks dari tirosin yang ternitrasi. Percobaan terhadap uji Millon hanya menghasilkan hasil yang positif terhadap larutan pepton

b)      Uji Ninhidrin

 Uji ninhidrin merupakan uji yang umum sifatnya karena dapat digunakan untuk mendeteksi protein yang memiliki sekurang-kurangnya satu gugus karboksil dan gugus amino bebas (asam α-amino). Apabila ninhidrin (triketohidrin) dipanaskan bersama asam amino, maka akan terbentuk kompleks berwarna biru. Kompleks berwarna biru dihasilkan dari reaksi ninhdrin dengan hasil reduksinya, yaitu hidrindantin dan amonia. Asam amino dapat ditentukan secara kuantitatif dengan jalan mengamati intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan konsentrasi asam amino tersebut. Pada reaksi ini, dilepaskan CO₂ dan NH₄ sehingga asam amino asam amino dapat ditentukan secara kuantitatif dengan mengukur jumlah CO₂ dan NH₃ yang dilepaskan. Prolin dan hidroksi prolin menghasilkan kompleks yang berbeda warnanya dengan asam amino lainya. Kompleks berwarna yang terbentuk mengandung dua molekul ninhidrin yang bereaksi dengan amonia yang dilepaskan pada oksidasi asam amino. Warna yang terbentuk pada prolin dan hidroksi prolin adalah kuning.

c)      Uji Biuret

Tes biuret merupakan salah satu tes  uji protein, bekerja pada suasana basa, dan akan memberikan perubahan warna pada larutan yang diuji menjadi berwarna violet dengan CuSO₄ , karena terbentuk kimpleks Cu²⁺ dengan gugus CO dan gugus NH dari rantai peptida dalam suasana basa.

Pada tes biuret ini, penambahan NaOH 2,5 M akan mengendapkan protein pada larutan Albumin, hal ini ditandai dengan bertambah jernihnya larutan albumin yang keruh. Pada larutan asam amino, penambahan NaOH 2,5 M tidak menyebabkan perubahan yang berarti. Pada penambahan CuSO₄ 0,01 M sebanyak 1 tetes menyebabkan larutan albumin mengalami perubahan yaitu larutan ini tidak tercampur dengan baik dan perubahan warna menjadi ungu muda atau violet hanya pada permukaan saja, sedangkan pada larutan asam amino glisin dan alanin terjadi perubahan warna pada permukaanya yaitu berwarna biru, sedangkan pada serin tidak terjadi perubahan warna.Hal ini disebabkan karena glisin dan alanin mengandung gugus hidroksil yang dapat membentuk kompleks dengan Cu²⁺.   Warna biru makin pekat  dengan penambahan CuSO₄ berlebih. Setelah dilakukan penambahan CuSO₄ 0,01  M berlebih, terjadi perubahan pada semua larutan, baik pada larutan albumin maupun larutan asam amino. Larutan albumin berwarna ungu muda, dan asam amino yang lain (Serin, Glisin, Alanin,) berwarna biru muda.

d)     Uji kougulasi

Protein akan mengalami koagulasi jika dipanaskan pada suhu 50^oC atau lebih. Proses koagulasi akan terjadi jika larutan protein berada pada titik isoelektriknya. Kelarutan protein akan berkurang pada suhu 50^oC karena pada suhu yang tinggi, energi kinetik pada protein akan meningkat sehingga terjadi kerusakan konformasi alamiah protein. Rusaknya konformasi alamiah protein tersebut menyebabkan terganggunya stabilitas dari larutan protein dan larutan protein mengalami koagulasi. Terjadinya koagulasi protein juga disebabkan karena adanya ion H⁺ dari CH₃COOH yang terikat pada gugus negatif dari protein. Ketika ion H⁺ tersebut masuk ke dalam larutan, ion H⁺ akan mempengaruhi keseimbangan dan pengkutuban muatan dari molekul protein. Penambahan asam asetat ke dalam larutan albumin berfungsi agar albumin mencapai titk isolistriknya dan proses koagulasi dapat tercapai. Hanya pada filtrat protein dilakukan uji biuret yang menghasilkan warna biru. Sedangkan pada uji kelarutan dalam air dan uji endapan dengan pereaksi millon tidak dilakukan.

e)      Pengendapan dengan alcohol

 Penambahan alkohol yang merupakan pelarut organik akan menurunkan kelarutan protein, karena kelarutaan suatu protein tergantung dari kedudukan dan distribusi dari gugus hidrofil polar dan hidrofob polar pada molekul. Mampu mengendapkan logam dalam suasan asam dan pada pH 4,7 yang merupakan titik isoelektrik.Pada reaksi pengendapan dengan alkohol, larutan albumin akan membentuk endapan yang disebabkan karena adanya gugus hidrofobik polar (yang menarik gugus non-polar) didalam molekul protein dan menghasilkan protein dipol. Menurut teori, albumin + HCl dan albumin + NaOH membentuk larutan bening sedangkan albumin + buffer asetat pH 4,7 agak keruh. Hal ini disebabkan karena pada pH 4,7 merupakan titik isoelektrik albumin. Titik isoelektrik merupakan pH dimana kelarutn protein minimum karena jumlah ion positif dan ion negatif sama sehingga penambahan senyawa organik seperti aseton dan alkohol yang bersifat nonpolar (muatan = 0) cenderung menurunkan kelarutan protein. Sedangkan dengan penambahan asam atau basa menyebabkan larutan albumin kelihatan agak bening, hal ini menandakan naiknya kelarutan albumin. Hal ini berdasarkan sifat protein yang amfoter (protein dalam suasana pelarut yang bersifat asam akan bertindak sebagai basa dan dalam suasana pelarut yang bersifat basa akan bertindak sebagai asam). 

f)       Denaturasi protein

Denaturasi protein merupakan perubahan terhadap struktur sekunder, tersier, dan kuartener molekul protein tanpa terjadinya pemecahan ikatan-ikatan kovalen. Denaturasi terjadi karena terpecahnya ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik, ikatan garam dan terbukanya lipatan molekul protein. Denaturasi, koagulasi dan redenaturasi dapat dibedakan sebagai berikut. Denaturasi protein adalah suatu keadaan telah terjadinya perubahan struktur protein yang mencakup perubahan bentuk dan lipatan molekul, tanpa menyebabkan pemutusan atau kerusakan lipatan antar asamamino dan struktur primer protein. Koagulasi adalah denaturasi protein akibat panas dan alkohol.

Pada percobaan denaturasi protein dibuat tiga larutan protein, dimana pada masing-masing larutan protein tersebut ditambahkan dengan senyawa yang berbeda. Tabung 1 berisi albumin yang ditambahkan dengan larutan HCl 0,1 M yang kemudian dipanaskan, tidak terjadi perubahan pada larutan albumin tersebut. Hal ini terjadi karena penambahan HCl yang bersifat sebagai asam kuat menyebabkan pH larutan protein menjadi sangat asam. Tabung 2 berisi albumin yang ditambahkan dengan NaOH 0,1 N kemudian dipanaskan, tidak menyebabkan perubahan pada larutan protein. Hal ini disebabkan karena larutan NaOH bersifat sebagai basa kuat, sehingga terjadi perubahan pH yang sangat extrem pada larutan protein menjadi basa.

Tabung 3 berisi albumin yang ditambahkan dengan buffer asetat kemudian dipanaskan, menyebabkan timbulnya endapan putih. Endapan putih yang terbentuk mengindikasikan terjadinya denaturasi protein. Denaturasi ini disebabkan karena buffer asetat sangat kuat mempertahankan pHnya pada pH 4,7 sehingga dapat merusak keseimbangan switer ion ke kondisi asam di bawah titik isoelektrik. Perubahan struktur yang diakibatkan proses denaturasi adalah perubahan konfigurasi protein α-heliks menjadi memanjang. Hal ini disebabkan karena rusaknya ikatan hidrogen dan ikatan nonpolar yang terjadi pada struktur berlipat dari protein. Tabung 1 dan 2 yang kemudian ditambahkan dengan larutan buffer asetat pH 4,7 mengalami pembentukkan endapan. Hal tersebut terjadi seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, yaitu terjadi denaturasi preotein karena buffer asetat sangat kuat mempertahankan pHnya pada pH 4,7.